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Este Cmap, tiene información relacionada con: Aluminum stress stimulates the accumulation of organic acids in root apices of Brachiaria species.(10), HPLC deacuerdo a Wenzl et al;(2001). Wensl,P.,G.M.PAtiño,A.L.Chaves,J.E Mayer,and I.M.Rao(2001) The high level of aluminum resistance in signalgrass is not associated with known mechanisms of external aluminum detoxification in root apices. Plant Physiol.125,1473-1484 Procedimiento Las muestras fueron disueltas en 42μL de agua desionizada y centrifugadas a 14000g x 10min Alicuotas de 25μL fueron analizadas en una columna Aminex HPX 87H de exclusion ionica (300x7.8 mm),usando una solucion isocratica con 12mM H2SO4 a 0.4 mL/min y 30°C., Aluminum stress stimulates the accumulation of organic acids in root apices of Brachiaria species. Tratamiento de raices y brotes Raíces previamente almacenadas en 400 μL de etanol al 70% a -80°C. Fueron homogenizadas y centrifugadas a 14000g por 5 min, fueron secadas en centrifuga SpeedVac, disueltas en 40 microlitros de H2O y centrifugadas a 14000g por 10 min., Los acidos organicos se pasaron por la columna de intercambio anionico. Despues de tres lavadas con 1mL de H2O cada acido organico fue eludido con 3x1 ml de 1M HCl, 10mM MgCl2 k Luego de una segunda reduccion a 50°C , los acidos se disolvieron en 300μLde H2O y se pasaron a través de filtros de 0,45micrometros, y se analizaron por HPLC, Los acidos organicos se pasaron primero por la columna de intercambio catiónico y luego fueron lavados adicionando 10mM MgCl2 ???? Luego de una segunda reduccion a 50°C , los acidos se disolvieron en 300μLde H2O y se pasaron a través de filtros de 0,45micrometros, y se analizaron por HPLC, Aluminum stress stimulates the accumulation of organic acids in root apices of Brachiaria species. Tratamiento de raices y brotes Muestras congeladas separadas en 2 alicuotas., Una de las alicuotas fue descongelada en 70% de etanol, y los acidos organicos se extrajeron a 75°C por una hora. Los pellets se obtuvieron después de una centrifugación a 2000g por 10 min. Se dio otra extracción con 1 ml de 70% de etanol y se centrifugó tal como antes. Tratamiento de muestras Luego de reducir el sobrenadante a 50°C, las muestras se disolvieron en 2x1 mL de H2O y se hicieron pasar por columnas de intercambio catiónico y anionico. (sulfonic acid and quaternary amine Bakerbond SPR columns, J.T. Baker Phillipsburg, NJ,USA), Las muestras fueron disueltas en 42μL de agua desionizada y centrifugadas a 14000g x 10min Alicuotas de 25μL fueron analizadas en una columna Aminex HPX 87H de exclusion ionica (300x7.8 mm),usando una solucion isocratica con 12mM H2SO4 a 0.4 mL/min y 30°C. Deteccion de acidos organicos Absorcion a 210nm, identificacion y cuantificacion por comparacion con tiempos de retencion y picos alcanzados por mezclas de estandares. La concentracion de los exudados recolectados fue analizada bajo las mismas condificones despues de pasarlos atraves de filtros de 0.45 μm, Tratada con mezcla de 65% (W/W) HNO3 y 70% (W/W) HClO4 en una proporción 2:1 a 200°C por 2 horas Determinación de Aluminio Espectrofotometro de absorcion atomica UNICAM 969, Determinación de aluminio insoluble, a partir de la diferencia entre aluminio total y aluminio soluble. Extractos de Aluminio Tratados con 6mL de un buffer que contenia 50mM Tris-Cl,250mM de sucrosa,100mM de KCl, y homogenizados con Ultraturrax a 4°C por 2x30s. Con posterior centrifugación a 30000g a 4°C por 1h. Los extractos que contenia aluminio soluble fueron divididos en 2 alicuotas, a otra fue mantenida en hielo, Muestras congeladas separadas en 2 alicuotas. Alicuota 1 Tratada con mezcla de 65% (W/W) HNO3 y 70% (W/W) HClO4 en una proporción 2:1 a 200°C por 2 horas, Permaneció en hielo ???? Ambas alícuotas fueron acidificadas adicionando HNO3 al 65%, fueron incubadas y secadas a 250°C. Los residuos fueron disueltos en pequeños volúmenes de HNO3. El aluminio en las muestras fue cuantificado por espectroscopia de absorción atómica horno de grafito, Muestras congeladas separadas en 2 alicuotas. Alicuota 2 Determinación de aluminio insoluble, a partir de la diferencia entre aluminio total y aluminio soluble., Tratados con 6mL de un buffer que contenia 50mM Tris-Cl,250mM de sucrosa,100mM de KCl, y homogenizados con Ultraturrax a 4°C por 2x30s. Con posterior centrifugación a 30000g a 4°C por 1h. Los extractos que contenia aluminio soluble fueron divididos en 2 alicuotas, a otra fue mantenida en hielo Alicuota 1 Sometida a ultrafiltración en una membrana con un tamaño de 5kD( Ultrafree MC filters; Millipone, Bedford, MA,USA), Luego de reducir el sobrenadante a 50°C, las muestras se disolvieron en 2x1 mL de H2O y se hicieron pasar por columnas de intercambio catiónico y anionico. (sulfonic acid and quaternary amine Bakerbond SPR columns, J.T. Baker Phillipsburg, NJ,USA) Segundo tratamiento Los acidos organicos se pasaron por la columna de intercambio anionico. Despues de tres lavadas con 1mL de H2O cada acido organico fue eludido con 3x1 ml de 1M HCl, 10mM MgCl2, Tratados con 6mL de un buffer que contenia 50mM Tris-Cl,250mM de sucrosa,100mM de KCl, y homogenizados con Ultraturrax a 4°C por 2x30s. Con posterior centrifugación a 30000g a 4°C por 1h. Los extractos que contenia aluminio soluble fueron divididos en 2 alicuotas, a otra fue mantenida en hielo Alicuota 2 Permaneció en hielo, Sometida a ultrafiltración en una membrana con un tamaño de 5kD( Ultrafree MC filters; Millipone, Bedford, MA,USA) ???? Ambas alícuotas fueron acidificadas adicionando HNO3 al 65%, fueron incubadas y secadas a 250°C. Los residuos fueron disueltos en pequeños volúmenes de HNO3. El aluminio en las muestras fue cuantificado por espectroscopia de absorción atómica horno de grafito, Luego de reducir el sobrenadante a 50°C, las muestras se disolvieron en 2x1 mL de H2O y se hicieron pasar por columnas de intercambio catiónico y anionico. (sulfonic acid and quaternary amine Bakerbond SPR columns, J.T. Baker Phillipsburg, NJ,USA) Primer tratamiento Los acidos organicos se pasaron primero por la columna de intercambio catiónico y luego fueron lavados adicionando 10mM MgCl2, Aluminum stress stimulates the accumulation of organic acids in root apices of Brachiaria species. Analisis de Acidos organicos HPLC deacuerdo a Wenzl et al;(2001). Wensl,P.,G.M.PAtiño,A.L.Chaves,J.E Mayer,and I.M.Rao(2001) The high level of aluminum resistance in signalgrass is not associated with known mechanisms of external aluminum detoxification in root apices. Plant Physiol.125,1473-1484, Aluminum stress stimulates the accumulation of organic acids in root apices of Brachiaria species. Tratamiento de Plantulas Cultivadas en soluciones que contenían(en μM): 100NO3,10NH4,60K,60Ca,30Mg,160Na,1H2PO4, 100SO4,5Fe,1Mn,1Zn,0.2Cu,6H3BO3,5SiO3, 0.001MoO4,5H2-EDTA,0.80 ó 0225Al,108.4,348.4 ó 783.4 ClY 65.4,55.4 o 38.4 HCl, con pH ajustado a 4.2. Los ápices fueron sumergidos en 500 μL de 70% etanol y almacenado a -80°C, Ambas alícuotas fueron acidificadas adicionando HNO3 al 65%, fueron incubadas y secadas a 250°C. Los residuos fueron disueltos en pequeños volúmenes de HNO3. El aluminio en las muestras fue cuantificado por espectroscopia de absorción atómica horno de grafito Tratamiento posterior Una de las alicuotas fue descongelada en 70% de etanol, y los acidos organicos se extrajeron a 75°C por una hora. Los pellets se obtuvieron después de una centrifugación a 2000g por 10 min. Se dio otra extracción con 1 ml de 70% de etanol y se centrifugó tal como antes.